流式細(xì)胞術(shù)是一項(xiàng)非常實(shí)用的技術(shù)，其特點(diǎn)是方便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確，且能成功的對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分選，但是提起流式抗體具體要怎么選，估計(jì)很多小伙伴都會(huì)犯難，實(shí)驗(yàn)前需要考慮的是流式抗體的選擇和熒光素的搭配，那么接下來(lái)就給大家分享一下在選擇流式抗體時(shí)有哪些注意事項(xiàng)吧。
 

　　選流式抗體需注意哪些問(wèn)題?
 

　　1、抗體的基本要求
 

　　a. 清楚知道待測(cè)靶標(biāo)是胞內(nèi)還是胞外蛋白;
 

　　b. 嚴(yán)格按照樣品來(lái)源選擇抗體反應(yīng)性;
 

　　c. 必須選擇明確標(biāo)注可用于流式實(shí)驗(yàn)的抗體，不能用普通抗體代替。
 

　　2、流式細(xì)胞儀的要求
 

　　a.了解所用的流式細(xì)胞儀有幾個(gè)激光器，常見的激光器有405nm、488nm和633nm等，目前大部分的流式細(xì)胞儀都配有488nm和633nm2個(gè)激光器;
 

　　b. 知道每個(gè)激光器下有幾個(gè)檢測(cè)通道，通道數(shù)決定一次多測(cè)多少個(gè)指標(biāo);
 

　　3、熒光標(biāo)記的選擇
 

　　a. 有直標(biāo)抗體的話，盡量選直標(biāo)，間接標(biāo)記二抗增加實(shí)驗(yàn)步驟，多次清洗造成會(huì)細(xì)胞損失，染色準(zhǔn)確性也低;
 

　　b. 弱表達(dá)靶標(biāo)，盡量選擇強(qiáng)熒光素標(biāo)記抗體，PE>APC>FITC>PerCP。
 

　　4、多色搭配方案
 

　　a. 每個(gè)通道只能用一種標(biāo)記，如FITC和AF488，兩種標(biāo)記的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)均相近，所以不能同時(shí)用這兩種標(biāo)記;
 

　　b. 盡量減少光譜重疊，如PE-cy5和APC，兩者同用時(shí)調(diào)補(bǔ)償值過(guò)大;
 

　　c. 弱靶標(biāo)配強(qiáng)熒光素，如Treg細(xì)胞中CD4表達(dá)量高于FoxP3，所以FoxP3應(yīng)使用強(qiáng)熒光素標(biāo)記抗體;
 

　　d. 五色及以上配色建議查閱文獻(xiàn)，或者咨詢抗體廠商。
 

　　5、如何調(diào)補(bǔ)償?
 

　　多色流式實(shí)驗(yàn)，由于各個(gè)熒光素存在光譜的重疊，因此需要進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)，在550nm附近，兩種染料存在光譜重疊。
 

　　下圖為CD3-FITC，CD4-PE的染色補(bǔ)償調(diào)節(jié)過(guò)程，調(diào)補(bǔ)償簡(jiǎn)單的一個(gè)詞就是：“橫平豎直”，慢慢理解哦!
 

　　6、同型對(duì)照?
 

　　同型對(duì)照的目的是為了減少背景干擾，更好展現(xiàn)抗原與抗體的結(jié)合強(qiáng)度，尤其對(duì)于一些胞內(nèi)蛋白、低表達(dá)或連續(xù)表達(dá)蛋白，同型對(duì)照的設(shè)置顯得尤為必要。同型對(duì)照需要選擇與染色的單克隆抗體相同種屬來(lái)源，相同抗體亞型，相同熒光標(biāo)記的抗體。